免疫共沉淀與Western Blot
實(shí)驗(yàn)步驟:
1．以60mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿為例，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24－36 小時(shí)后，吸凈培養(yǎng)液（可用PBS
小心漂洗一次）。
2．加入500μl 預(yù)冷的1×lysis buffer, 于4℃或冰上放置裂解細(xì)胞5 分鐘。
3．將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 ml eppondorf 管內(nèi)，于冷凍離心機(jī)4℃，13000 g 離心30
分鐘。
4．將離心后的上清液分為兩份：一份35μl，加入等體積的2×SDS sample buffer, 混
勻后于100℃煮10 分鐘，做為總細(xì)胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃
保存，或取6－10 μl 進(jìn)行SDS－PAGE 電泳，Western blot 檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)
水平（接第5 步）。另一份用于免疫沉淀，具體操作如下：
1） 分A/G beads：按每管（一個(gè)免疫沉淀樣品）加入5 μl Agrose A/G beads
及5 μl（1 μg）抗體計(jì)算一次實(shí)驗(yàn)所用beads 及抗體的總量，將抗體和beads 混
合，補(bǔ)充lysis buffer （補(bǔ)充的lysis buffer 的量能使每管能均勻分配到50 μl beads
及抗體的混合物），將beads 及抗體的混合物按每管50 μ（l 含5 μl beads 及5 μl 抗
體）分配到1.5 ml Eppendorf 管中，再加入400 μl 1×lysis buffer，備用；
2） 從步驟4 中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400 μl 加入到上一步（步驟
1））已分好的beads 中，使終體積達(dá)到850 μl，將管子固定到混勻器上使混勻器
勻速旋轉(zhuǎn)（15 rpm）免疫沉淀3 小時(shí)；
3） 將免疫沉淀后的溶液于4℃ 3000 rpm 離心3 分鐘，去上清，加入500μl
1×lysis buffer 洗滌beads，于冷凍離心機(jī)4℃ 3000 rpm 離心3 分鐘，棄上清，共
洗滌三次。
4）*后一次洗滌完畢，棄上清，管中只剩Beads，加入35 μl 1×lysis buffer 與
等體積2×SDS sample buffer 混合，于100℃煮沸10 分鐘，稍離心后取10μl 左右
上樣到PAGE 膠，進(jìn)行電泳，或－20℃凍存。
5．電泳完畢，取下PAGE 膠，與PVDF 膜做成"三明治"形狀，用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行電轉(zhuǎn)1
小時(shí)。
6．電轉(zhuǎn)完畢，取下PVDF 膜，加入5％脫脂奶粉，于脫色搖床搖蕩（75 rpm）封閉
1 小時(shí)以消除非特異背景。
7． 封閉完畢，用TBST 洗掉牛奶，加入一抗，于脫色搖床搖蕩孵育（75 rpm）1
小時(shí)，使一抗與特異蛋白結(jié)合。
8． 回收一抗，用TBST 洗3 次（75 rpm），每次5－10 分鐘。
9． 加入二抗，于脫色搖床孵育1 小時(shí)，使二抗與一抗結(jié)合。
10．用TBST 洗3 次，每次5－10 分鐘。
11．將ECL A 液和ECLB 液各1ml，混勻，放入二抗孵育后的PVDF 膜30 秒，將
PVDF 膜平鋪于曝光盒中，進(jìn)暗房，用醫(yī)學(xué)X 光膠片曝光。
12．經(jīng)過(guò)顯影、定影后的膠片，于室溫下自然風(fēng)干或烘干，描畫蛋白marker 便于分
析。
注：如只做Western Blot，跳過(guò)步驟4 即可。
實(shí)驗(yàn)試劑：
1．PBS：
NaCl 20mM, KCL 2.68mM, Na2HPO410mM, KH2PO4 1.76mM （pH7.4），室溫保
存。
2．1×lysis buffer：
Tris-HCl 20 mmol/L（pH7.5）, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Triton
X-100 1%, Sodium pyrophosphate 2.5 mM, β-Glycerrophosphate 1 mM, NaVO4
1 mM, Leupeptin 1 ug/ml,－20℃保存。（稀釋成1×lysis buffer 后加入1 mM
PMSF ）
3．2×SDS sample buffer：
Tris-Cl（pH 6.8）125 mM，SDS 4%，甘油20%，DTT 100 mM，溴酚蘭0.02%，
室溫保存。
4．分離膠（下層膠）（10% SDS-PAGE）15 ml：
30% 丙烯酰胺5 ml，10×lower buffer （pH 8.8） 1.5 ml，H2O 8.5 ml，10% AP 15
μl，TEMED 15 μl。
5．10 × lower buffer （pH 8.8） 100 ml：
42.25 g Tris base，10 ml 10％SDS，室溫保存。
6．壓縮膠（上層膠）（4 % SDS-PAGE）5 ml：
30% 丙烯酰胺0.65 ml，4×stacking buffer （pH 6.8） 1.25 ml，H2O 3.05 ml，10%
AP 5 μl，TEMED 5 μl。
7．4 × stacking buffer （pH 6.8） 100 ml：
6.06 Tris base，4 ml 10％SDS，室溫保存。
8．電泳緩沖液：
Tris base 0.125 M，甘氨酸0.96 mM，SDS 0.5%，室溫保存。
9．電轉(zhuǎn)緩沖液：
Tris 25 mM，甘氨酸0.2 mM，甲醇10%，室溫保存。
10．10×TBS （pH 7.6）：
Tris base 2.42%，NaCl 8%，室溫保存。
11．TBST：
1×TBS，Tween-20 0.1%，室溫保存

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